一、介绍

类器官培养技术是一种利用干细胞或肿瘤组织在体外三维（3D）微环境下进行自组织培养，形成具有一定空间结构和功能的微型器官的技术。这些类器官能够高度模拟真实器官的特征，包括组织学结构和生理功能。培养方法主要包括浸没式基质胶培养、气液界面培养和生物反应器培养等。

二、操作流程

1 实验材料准备

1.1．仪器设备：

CO₂培养箱、超净工作台、倒置显微镜、台式离心机、水浴锅/摇床、-80℃冰箱、冰盒。

眼科剪/镊、移液器、15 mL离心管、100 μm滤筛、24孔低吸附培养板。

2.2．试剂耗材

培养基：选择组织特异性培养基。

基质胶：低因子、无酚红型，需4℃过夜融化，操作全程冰上进行[1]。

消化液：胶原酶（I/IV型）、胰蛋白酶。

其他：组织保存液、类器官冻存液（含DMSO）。

2 原代类器官培养步骤

2.1 样本处理

取材与保存：离体组织立即浸入4℃预冷组织保存液（含双抗），运输时间≤72小时。

清洗剪碎：PBS（含双抗）冲洗3次，去除血污；立体显微镜下剔除脂肪/坏死组织剪成1-3 mm³碎片，转移至15 mL离心管。

组织消化：配制胶原酶+胰蛋白酶混合液，37℃预热。 按组织体积1:4加入消化液[2]，37℃摇床（120 rpm）消化20-60分钟；每5分钟取样镜检，至细胞团（5-50个细胞）出现时终止。

终止与过滤：加入3倍体积终止缓冲液（如含FBS的培养基）；100 μm滤筛过滤，离心（300g，5分钟）弃上清。

2.2 培养基配制

基础培养基：选择适合细胞生长的基础培养基，需选择添加以下成分：

生长因子：EGF（促进增殖）[3]、Wnt3a（维持干细胞特性）[4]、Noggin（抑制分化）[5]、R-spondin1（增强Wnt信号）[6]。

小分子化合物：如Y-27632（ROCK抑制剂，减少细胞凋亡）[7]。

pH与渗透压：严格校准至7.4，避免影响细胞代谢。

2.3 基质胶接种

细胞重悬：沉淀用预冷PBS清洗1次，按1×105[8]个细胞/50 μL基质胶比例重悬。

点板固化：24孔板每孔点胶50 μL（避免气泡）；37℃培养箱静置30分钟，待胶凝固后加入500 μL培养基。

2.4 培养与观察

培养条件：37℃、5% CO₂，每2-3天换液（吸弃旧液，沿孔壁缓慢加入新培养基）。

形态监测：初期（3-5天）：类器官呈囊状或实心球体；成熟期（10-14天）：直径200-500 μm[8]，结构致密。

3 类器官传代

3.1 收集与洗涤：

吸弃培养基，加入4℃预冷缓冲液（如PBS），吹打分散胶体。300g离心5分钟，弃上清及基质胶层；若分层不清，重复冷化步骤或弃上1/3悬液。

3.2 消化与分选：

加入消化液（37℃，2-3分钟），吹打成2-10细胞团；加入5倍体积缓冲液终止，离心后按1:2-1:3比例接种。

4 冻存与复苏

4.1 冻存：

类器官直径100-200 μm时（指数生长期）。收集类器官，加入冻存液（90% FBS+10% DMSO）；梯度降温（4℃→-20℃→-80℃→液氮）。

4.2 复苏

快速解冻：37℃水浴1-2分钟，PBS清洗2次；

重悬培养：按原代步骤接种，初期培养基添加ROCK抑制剂。

参考文献

[1]. Else Driehuis, Kai Kretzschmar and Hans Clevers . Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. NATURE PROTOCOLS, 2020 Oct;15(10):3380-3409.

[2]. Boehnke K , Iversen P W , Schumacher D ,et al.Assay Establishment and Validation of a High-Throughput Screening Platform for Three-Dimensional Patient-Derived Colon Cancer Organoid Cultures[J].Journal of Biomolecular Screening, 2016:931-941.DOI:10.1177/1087057116650965.

[3]. 洪伦.生长因子诱导的上皮-间质转化在人结肠癌细胞中的研究[D].中南大学,2011.DOI:10.7666/d.y1914894.

[4]. 丁界先,张津,陈永刚,王兴文,王栓科.Wnt信号通路与肿瘤发生的研究进展[J].实用肿瘤学杂志,2019,33(1):73-77

[5]. 刘卓健,马军,杜鸣,等.食管鳞癌类器官培养体系的构建[J].胃肠病学和肝病学杂志, 2022(003):031.DOI:10.3969/j.issn.1006-5709.2022.03.012.

[6]. 伏晓,仇毓东.一种结肠癌类器官的培养基及其应用:CN202111156653.5[P].CN113846061A[2025-03-04].

[7]. Li H, Zhang C, Hu Y, et al. A reversible shearing DNA probe for visualizing mechanically strong receptors in living cells. Nat Cell Bio. 2021 Jun;23(6):642-651.

[8]. Driehuis E , Kretzschmar K , Clevers H .Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications (vol 63, pg 891, 2020)[J].Nature protocols erecipes for researchers, 2021(12):16.