条件性重编程培养技术

1.简介   

2017年，来自美国乔治城大学刘学峰课题组提出条件重编程细胞（Conditional reprogrammed cells，CRCs）可在实验室中无限制培养出正常的细胞和肿瘤细胞的技术【1】。该技术是指将铯源γ射线辐照过的 Swiss-3T3-J2 小鼠成纤维饲养细胞与人正常细胞或肿瘤细胞共同培养，通过添加Rho相关蛋白激酶(Rho-associated kinase, ROCK)抑制剂Y-27632，使正常细胞或肿瘤细胞获得部分干细胞特性和在体外无限制复制能力的一种细胞培养技术。

2.技术流程【1】

2.1饲养层细胞培养

（1）将Swiss-3T3-J2小鼠成纤维细胞培养在37°C，5%CO2培养箱，每周传代2-3次。

（2）传代时，用PBS冲洗1次，然后用0.05%的胰酶/EDTA溶液在室温下孵育20 s。加入4倍体积的DMEM完全培养液终止消化。

（3）300g，离心5min。

（4）细胞沉淀重悬于10ml的DMEM完全培养液中，按照1x103细胞/cm2 细胞铺板，置于37°C，5%CO2培养箱中进行培养。

2.2新鲜组织的运输、处理

（1）新鲜组织在术后12小时内，无菌条件下进行运输和处理。

（2）用95-100%乙醇快速冲洗切除的组织样本（最多3s），然后用冷（4℃）PBS清洗后转移到无菌培养皿中。

（3）使用镊子和手术刀，去除残留的脂肪组织。

（4）将组织切成小于10mm的小块。将组织小块置于5ml的组织保护液中，经冷链（2-8℃）运输至实验室.

2.3原代细胞分离

（1）配制10x胶原酶/透明质酸酶溶液于15ml离心管中。取F培养基和10x胶原酶/透明质酸酶混合溶液按照3:1进行混合。

（2）用95-100%乙醇快速冲洗切除的组织样本（最多3s），然后用冷（4°C）PBS冲洗。

（3）将组织切成小于1mm3的小块。

（4）将组织碎片转移到含有4mlF培养基/胶原酶/透明质酸酶/分配酶的15ml离心管中，在37°C上摇晃孵育1-3小时。

（5）解离后，4°C，500g离心5 min，弃上清。将细胞沉淀重悬于10 ml完全DMEM培养液中。

（6）通过100µm的细胞过滤器将细胞悬液过滤到一个新50ml离心管中。4℃，300g离心5 min，弃上清。

2.4饲养层细胞辐照和共培养

（1）取培养至80-90%汇合度的Swiss-3T3-J2小鼠成纤维细胞，用PBS冲洗1次，然后用0.05%的胰酶/EDTA溶液在室温下孵育20 s。

（2）加入4倍体积的DMEM完全培养液终止消化。

（3）300g，离心5min。细胞沉淀重悬于10ml的DMEM完全培养液中进行30Gy的适当辐照（采用平行培养，确保照射后J2细胞没有增殖）。

（4）辐照后，立即将J2细胞与处理过的组织或所需的上皮细胞一起放在T25瓶中（1×104细胞/cm2），放在完全F培养基中。

（5）保持共培养在37°C，95%湿度和5%CO2培养箱中，直到汇合。

2.5差异胰酶处理共培养细胞进行传代

（1）取共培养且汇合细胞，用PBS冲洗1次，然后用0.05%的胰酶/EDTA溶液在室温下孵育20 s，镜下观察消化情况，仅保持上皮细胞克隆存在。

（2）用PBS冲洗上皮细胞，然后用1ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA在37℃下重新处理5 min。

（3）加入4倍体积的完全DMEM培养液终止细胞消化，收集混合液于15ml离心管中。

（4）4℃，300g离心5 min，弃上清。细胞沉淀加入F培养基重悬，按照一定比例进行传代培养。

3.应用

CR 技术为细胞永生化的研究带来了希望，在原代细胞培养、肿瘤治疗等研究领域展现出了巨大的应用前景。

3.1原代细胞培养方面的应用【2】

目前CR 技术已用于肺部、乳腺、结肠、食管、包皮上皮和子宫颈阴道部及尿液脱落膀胱癌细胞的分离培养【3-5】。同时，该技术培养细胞，在成人上皮细胞中表现出干细胞特性【6】。

3.2肿瘤治疗方面的应用【7】

Yuan等【8】利用CRCs建立了侵袭性复发性呼吸道乳头状瘤患者的正常和肿瘤肺组织细胞培养物。该研究应用基因组学分析发现喉癌肿瘤细胞含有野生型7.9-kb人乳头状瘤病毒11型基因组，肺肿瘤细胞含有10.4-kb基因组。进一步利

用药物敏感性测试，确定伏立诺他胺作为特异性潜在的治疗剂，临床治 3 个月后，病灶开始缩小。

Timofeeva等【5】利用培养出的前列腺正常细胞和肿瘤细胞，证明基底细胞群作为前列腺肿瘤的主要来源，同时说明 CRCs 在饲养细胞和 Y-27632 存在的条件下可维持高水平的增殖和低水平的分化，一旦置于体内或模拟其自然环境的条件下可完全分化。研究者研究多西他赛对CRCs的敏感性，匹配的正常细胞和肿瘤细胞的IC50值分别是1.79 µm和0.29 µm，这些数据可以说明匹配的正常和肿瘤细胞可用于患者的个体化治疗或者用于发现新型药物。

黎张燕等【10】利用CRCs技术建立肺癌体外培养体系，采用MTS方法检测6例肺腺癌细胞对临床常规化疗药物顺铂、卡铂、奈达铂、长春瑞滨的敏感程度，结果显示患者肺腺癌细胞整体对铂类药物敏感率高，而对长春瑞滨的敏感率低，与临床情况具有一致性，也与之前的研究结果相似。

4.参考文献

【1】Liu X, Krawczyk E, Suprynowicz FA, Palechor-Ceron N, Yuan H, Dakic A, Simic V, Zheng YL, Sripadhan P, Chen C, Lu J, Hou TW, Choudhury S, Kallakury B, Tang DG, Darling T, Thangapazham R, Timofeeva O, Dritschilo A, Randell SH, Albanese C, Agarwal S, Schlegel R. Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens. Nat Protoc. 2017 Feb;12(2):439-451. doi: 10.1038/nprot.2016.174. Epub 2017 Jan 26. PMID: 28125105; PMCID: PMC6195120.

【2】叶方叠,姜昊文.条件重编程培养技术体外长时程分离培养原代细胞的应用进展[J].复旦学报：医学版, 2020, 47(5):7.DOI:10.3969/j.issn.1672-8467.2020.05.019.

【3】Ahmad,M,Alamri,et al.Primary cancer cell culture: mammary-optimized vs conditional reprogramming[J].Endocrine Related Cancer, 2016.

【4】Jensen T J , Foster C , Sayej W ,et al.Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation[J].Journal of Visualized Experiments Jove, 

【5】Timofeeva O A , Palechor-Ceron N , Li G ,et al.Conditionally reprogrammed normal and primary tumor prostate epithelial cells: a novel patient-derived cell model for studies of human prostate cancer[J].Oncotarget, 2016.

【6】Suprynowicz F A , Kamonjoh C M , Ewa K ,et al.Conditional cell reprogramming involves non-canonical β-catenin activation and mTOR-mediated inactivation of Akt[J].Plos One, 2017, 12(7):e0180897.

【7】张卉卉,俞万钧.条件重编程细胞在肿瘤治疗中的研究进展[J].中国肿瘤临床, 2018, 45(15):4.DOI:CNKI:SUN:ZGZL.0.2018-15-015.

【8】Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis. [J].New England Journal of Medicine, 2012, 367(13):1220.

【9】黎张燕,唐欲博,罗红鹤,等.人原代肺癌细胞体外长期培养及个体化药敏研究[J].今日药学, 2017, 27(2):6.DOI:CNKI:SUN:YAXU.0.2017-02-013.