脐带间充质干细胞培养技术

1.简介 

   间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一类来源于中胚层的成体干细胞，具有自我更新和多向分化的潜能。 研究表明,MSCs 广泛存在于成体及胎儿的各种组织中，如骨髓【1】、外周血【2】、脂肪组织【3】、羊膜和脐带【4】、胎盘【5】、牙髓【6】、皮肤等【7】。

2.技术流程【8-9】

2.1脐带间充质干细胞的分离培养

（1）无菌采集健康产妇剖宫产中的胎儿脐带15 -20 cm，装入预先放置 PBS（含 2%青霉素+2%链霉素）的密封容器中带回实验室。

（2）于实验室超净工作台内，反复冲洗以除去脐带组织表面的血凝块，用止血钳

（3）夹住脐带两端，放入 75%医用酒精浸泡 1 min 左右。

（4）然后转移至 PBS 中清除脐带表面残余的酒精,将脐带剪成 2-3 cm 的片段，放入PBS 中，以除去脐带动脉、静脉中的血细胞。

（5）随后用组织剪剪开脐静脉,去除脐静脉、脐动脉及脐带外膜,分离出华通氏胶组织，PBS 反复冲洗后将华通氏胶剪成 2- 3 mm组织块均匀铺于60 mm 培养皿中。

（6）添加少量培养液以保持组织块湿润。将培养皿放入CO2培养箱，静置12 h后，沿培养皿侧壁轻柔加入少量培养液，继续培养，每5 d换液1次。

2.2细胞增殖能力测定

（1）取培养的第4代人脐带间充质干细胞进行细胞增殖能力的测定，用0.25%的胰蛋白酶消化人脐带间充质干细胞，离心后去上清。

（2）加入含体积分数10%的胎牛血清的 DMEM 培养液使细胞重悬，调整细胞浓度至1x104个细胞/ml，接种于24孔细胞培养板，每孔1 ml细胞悬液。 

（3）将培养板置于CO2培养箱中，每3 d更换培养基1次。在第2，4，6，8，10，12天分别取3孔细胞，消化后用细胞计数仪进行计数。

（4）以培养时间为横轴、细胞数量为纵轴，绘制第4代人脐带间充质干细胞的生长曲线。

2.3细胞表面抗原检测

（1）取培养的第4代人脐带间充质干细胞进行细胞增殖能力的测定，用0.25%的胰蛋白酶消化人脐带间充质干细胞，离心后去上清。

（2）加入含体积分数10%的胎牛血清的 DMEM 培养液使细胞重悬，调整细胞浓度至1x105个细胞/ml，固定于体积分数为70%冷乙醇中，4 ℃过夜后，用于流式细胞仪进行细胞表面标志的测定。

（3）细胞分别与鼠抗人的FITC-CD90、PE-CD86 、FITC-CD45 、PE-CD19 、FITC-CD105 、PE-HLA-DR、FITC-HLA-ABC和PE-CD34抗体反应，在 4 ℃的暗室中放置30 min。以鼠抗人PE/FITC-IgG1为平行对照。数据用Cell Quest软件处理。

2.4多项分化能力的检测

（1）取培养的第4代人脐带间充质干细胞分别进行成骨、成脂、成软骨方向的诱导鉴定。

3.定向分化研究进展【10】

目前国内外文献中记载的由人脐带华通氏胶间充质干细胞定向分化成的细胞种类已达 18 余种。在近 5 年的文献报道中，一部分研究改进了之前的诱导方法；另一部分研究开拓了人脐带华通氏胶间充质干细胞定向分化的新方向；还有部分研究初步探索了分化过程中涉及的信号通路及相关的分子机制。

4.参考文献

【1】Gardner OF, Alini M, Stoddart MJ. Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Bone Marrow. Methods Mol Biol. 2015;1340:41-52.

【2】Chong PP, Selvaratnam L, Abbas AA, Kamarul T. Human peripheral blood derived mesenchymal stem cells demonstrate similar characteristics and chondrogenic differentiation potential to bone marrow derived mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 2012 Apr;30(4):634-42

【3】Doornaert M, De Maere E, Colle J, Declercq H, Taminau J, Lemeire K, Berx G, Blondeel P. Xenogen-free isolation and culture of human adipose mesenchymal stem cells. Stem Cell Res. 2019 Oct;40:101532.

【4】Hendrijantini N, Hartono P. Phenotype Characteristics and Osteogenic Differentiation Potential of Human Mesenchymal Stem Cells Derived from Amnion Membrane (HAMSCs) and Umbilical Cord (HUC-MSCs). Acta Inform Med. 2019 Jun;27(2):72-77.

【5】Thaweesapphithak S, Tantrawatpan C, Kheolamai P, Tantikanlayaporn D, Manochantr S. The Biological Characteristics of Placenta Derived Mesenchymal Stem Cells Cultured in Human Serum. J Med Assoc Thai. 2016 Jul;99 Suppl 4:S75-83. PMID: 29917345.

【6】Tsai AI, Hong HH, Lin WR, Fu JF, Chang CC, Wang IK, Huang WH, Weng CH, Hsu CW, Yen TH. Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Deciduous Teeth Pulp. Biomed Res Int. 2017;2017:2851906.

【7】Mushahary D, Spittler A, Kasper C, Weber V, Charwat V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 2018 Jan;93(1):19-31.

【8】陈凤,杨敏,李彦洁,等.人脐带间充质干细胞的分离培养及多向分化潜能研究[J].生物学杂志, 2021.

【9】王菲,周洪,郭昱成,et al.原代人脐带间充质干细胞培养方法的研究[J].中国组织工程研究, 2014, 18(19):6.

【10】施沁,杨晓清,张玉泉,等.人脐带华通氏胶间充质干细胞定向分化:现状与前景[J].中国组织工程研究, 2018.