外周血T淋巴细胞培养技术

1.简介 【1】

   T 细胞是一类多样且重要的淋巴细胞，它们在胸腺中经历阳性和阴性选择变成熟。在主动免疫的两个组成部分（即细胞介导免疫和一定程度上的体液免疫）中都发挥着重要作用。T 细胞有多种类型，最常见的类型是 CD4+ T 细胞（辅助性 T 细胞）和 CD8+ T 细胞（细胞毒性 T 细胞或杀伤性 T 细胞）。T 细胞不能识别可溶性的游离抗原。T 细胞只能识别基于蛋白质、与受体结合的抗原。这种识别是通过使用 MHC（也称为 HLA）1 和 2 受体来实现的，它们与 TCR（T 细胞受体）一起与相关抗原结合，形成一个复合体，使 T细胞能够识别抗原。CD4+ T 细胞能识别与 MHC 2 结合的抗原，而 CD8+ T 细胞则能识别与 MHC 1 结合的抗原。

2.技术流程

2.1外周血单核细胞（PBMC）的分离

（1）采用含肝素钠的无菌采集管收集人静脉血10ml，并轻轻颠倒该管几次混合均匀。

（2）取10ml Ficoll在50ml离心管中。

（3）使用自动移液器轻轻地分层的血液在Ficoll的顶部。 分层应该非常缓慢，血液和Ficoll应该保持为两个不同的层。

（4）4℃下，升1降1，900g，离心30min。

（5）离心完成后吸取 PBMC 细胞层的细胞，转移至50ml离心管中，在离心管中加入 等体积的1640 培养基，使用吸管轻柔吹打细胞悬液3-5次，重悬细胞。

（6）4℃下，400g，离心5min，收集PBMC细胞沉淀备用。

2.2抗CD3抗体包被

（1）用无菌 PBS 稀释抗 CD3 抗体（浓度为 1 µg/ml），然后在6孔板中包被抗 CD3 抗体，每孔添加2ml包被液，将培养板放入 5% CO2 培养箱中，在 37°C 下孵育 2小时。

（2）2 小时后，从培养箱中取出 6 孔板。吸出抗 CD3 溶液并丢弃。不要清洗培养板备用。

2.3外周血T淋巴细胞的活化培养

（1）取PBMC细胞沉淀，加1640培养基（含10%灭活FBS+2 mM L-谷氨酰胺+ 5 µg/ml的抗 CD28+1%双抗）重悬至5x105个细胞/ml。

（2）按照每3m/孔，接入到包被好的6孔板中。

（3）置于37℃，5%CO2培养箱中培养。

（4）每3天补液1次，观察外周血T淋巴细胞的活化培养情况并绘制生长曲线。

3.T淋巴细胞在肿瘤中的研究进展【2】

CD4+ T 淋巴细胞通过一系列机制参与调节肿瘤的固有和适应性免疫。依据其功能不同可划分为多个亚群，主要包括 Th1、Th2、Th17 等【3】。CD8+ T 淋巴细胞占外周血淋巴细胞的 24%~30%，其主要作用是直接杀伤靶抗原(如病毒和肿瘤细胞等)，因此被称为细胞毒性 T 淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes, CTL)。

目前普遍认为 CD8+ T 细胞被认为是抗肿瘤免疫的主要驱动因素，CD4+ T 细胞在肿瘤控制中也发挥着突出的作用，可以促进或抑制抗肿瘤反应【4-5】。大多数癌细胞不表达 MHC II 类分子(MHC II)，因此不能直接被 CD4T细胞识别，而是通过肿瘤基质细胞交叉呈递肿瘤抗原来识别【6】。肿瘤浸润性 CD8+ T 淋巴细胞的丰度和 T 的表达升高特征，与许多不同肿瘤类型患者的无病生存期或总生存期延长显著相关，包括乳腺癌、肺癌、结直肠癌、黑色素瘤、头颈癌、食管癌、胃癌、肝细胞癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜腺癌和膀胱癌。肿瘤特异性 CD8+ T 淋巴细胞可以通过产生细胞毒性分子以 MHC-I 限制的方式直接杀死肿瘤细胞【7】。

4.参考文献

【1】Sauls RS, McCausland C, Taylor BN. Histology, T-Cell Lymphocyte. [Updated 2023 May 1]. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls

【2】陈飞, 晏冬. T淋巴细胞在肿瘤中的研究进展[J]. 临床医学进展, 2024, 14(4): 3012-3020.

【3】Basu, A., Ramamoorthi, G., Albert, G., et al. (2021) Differentiation and Regulation of TH Cells: A Balancing Act for Cancer Immunotherapy. Frontiers in Immunology, 12, Article 669474.

【4】Poncette, L., Bluhm, J. and Blankenstein, T. (2022) The Role of CD4 T Cells in Rejection of Solid Tumors. Current Opinion in Immunology, 74, 18-24.

【5】Kim, H.-J. and Cantor, H. (2014) CD4 T-Cell Subsets and Tumor Immunity: The Helpful and the Not-So-Helpful. Cancer Immunology Research, 2, 91-98.

【6】Ohshima, K. and Morii, E. (2021) Metabolic Reprogramming of Cancer Cells during Tumor Progression and Metastasis. Metabolites, 11, Article 28.

【7】Martinez-Usatorre, A., Carmona, S.J., Godfroid, C., et al. (2020) Enhanced Phenotype Definition for Precision Isolation of Precursor Exhausted Tumor-Infiltrating CD8 T Cells. Frontiers in Immunology, 11, Article 340.