文献解读丨具有神经-血管生成功能的抗菌仿生骨膜用于骨再生

英文标题：

An Antibacterial Bionic Periosteum with Angiogenesis Neurogenesis Coupling Effect for Bone Regeneration

使用产品：BS-1105

培养细胞：骨髓间充质干细胞

培养效果：良好

摘要：

骨膜富含神经血管网、骨祖细胞和干细胞，对骨修复至关重要。目前人工骨膜材料在机械强度、细菌感染、促进成骨分化和血管生成等方面面临挑战。为了解决这些问题，我们调整了聚ε-己内酯和壳聚糖的静电纺丝比例，并将锌掺杂的白磷钙石和聚多巴胺涂层加入到纳米纤维膜中。经过一系列表征，聚己内酯与壳聚糖的比例为8:1，纳米粒含量为5%时获得了最优的结果。在体外细胞实验和体内颅骨缺损模型中，Mg2+和Ca2+的持续释放分别促进血管化和新骨形成，而Zn2+的释放有利于抗菌，并与Mg2+协同促进神经血管化。因此，这种具有血管生成-神经生成耦合效应的抗菌仿生骨膜在骨修复方面具有良好的应用前景。

前言：

骨膜在骨修复和再生中扮演着关键角色，但在传统骨修复材料设计中常被忽视。骨膜通过提供营养、保护和干细胞调节来促进骨骼生长和愈合。临床研究显示，骨膜损伤会影响骨移植的营养供应，而保留骨膜则有助于骨再生。异体骨膜的应用受到免疫排斥、二次损伤和供体不可用性的限制。仿生骨膜因其结构和功能与自然骨膜相似，成为治疗骨缺损的潜在选择。组织工程骨膜虽能促进骨再生，但存在病毒感染和细胞存活问题。无需细胞加载的仿生骨膜可能是一种更简单的修复策略。静电纺丝技术用于制备多孔可生物降解聚合物纤维膜，模仿骨膜结构以促进干细胞功能。聚己内酯（PCL）和壳聚糖（CS）是常用于静电纺丝的生物材料，但各有优缺点。CS具有抗菌性，而PCL具有良好的生物相容性和机械性能。聚苯胺-壳聚糖复合纳米纤维膜能刺激细胞形成，但骨再生还需添加生物活性矿物。羟基磷灰石（WH）作为骨移植替代品，能释放促进骨再生的离子。聚多巴胺（PDA）促进细胞粘附和骨分化。研究构建了PCL/CS/PDA@Zn-WH复合人工骨膜，发现其在体外和体内实验中均显示出优异的成骨诱导能力和促进早期神经血管化，为生物材料设计提供了新见解。

结果与讨论：

1、聚己内酯和壳聚糖不同比例的形态学和机械性

通过将壳聚糖与聚己内酯（PCL）混合来改善壳聚糖的可纺性，并研究了混合比例对纳米纤维结构和物理化学性质的影响。研究发现，随着壳聚糖含量的增加，纳米纤维的直径减小，表面张力增加，需要更高的电场力来形成纤维。壳聚糖的增加导致纳米纤维膜断裂时的应变降低，但由于氢键作用，拉伸应力增加。在不影响断裂伸长的前提下，PCL与CS比例为8:1时展现出最佳的机械性能。亲水性测试显示，增加CS比例可以增强膜的亲水性，使膜从疏水性转变为亲水性。最终，研究选择了PCL:CS = 8:1的比例进行后续实验。

2、纳米颗粒的表征

通过水热法成功合成了Zn-WH（掺杂锌的白钨矿）和WH（白钨矿），并通过X射线衍射（XRD）和X射线光电子能谱（XPS）分析确认了Zn-WH的晶体相和元素组成。Zn2+掺杂未改变WH的晶体结构，XPS分析显示Zn、Ca、Mg、P和O的特定含量。为了增强Zn-WH的粘附性、成骨和血管生成能力，使用聚多巴胺（PDA）对Zn-WH进行了表面修饰，并通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）证实了PDA的成功修饰。扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）分析显示，PDA修饰后的PDA@Zn-WH粒径平均为168纳米，聚多巴胺层厚度约为10纳米，且纳米粒子尺寸未有明显变化。能量色散X射线光谱（EDS）分析进一步确认了纳米粒子中元素的均匀分布。

3、不同纳米颗粒含量的纳米纤维膜的物理和化学性质

研究探讨了不同重量的纳米颗粒掺杂对纳米纤维膜的影响。SEM分析显示，掺杂纳米颗粒增加并未改变纤维直径，保持在约250纳米，表明纳米颗粒的加入未影响纺丝溶液的表面张力。随着纳米颗粒含量的增加，膜的拉伸强度先增后减，在5%含量时达到最大值，归因于纳米纤维与纳米颗粒间的氢键相互作用。超过5%后，机械性能下降，可能是由于应力集中。TG分析确认了复合纳米纤维膜中纳米颗粒的最佳含量为5%，TEM分析显示纳米颗粒在纳米纤维膜中均匀分布。

4、抗菌特性

在骨科植入物设计中，抗菌特性至关重要，因为植入物相关感染可能导致严重并发症，降低患者生活质量。本研究通过金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌落形成单位（CFU）测定法评估了不同纳米纤维膜的抗菌特性。结果显示，壳聚糖（CS）组对这两种细菌表现出轻微抗菌性，但由于CS的正电荷与细菌细胞膜的负电荷相互作用，破坏了细胞膜结构，抗菌效果较弱。当纳米纤维膜中加入Zn-WH或PDA@Zn-WH纳米颗粒时，抗菌性能显著提高，因为这些纳米颗粒能释放Zn2+，实现高效抗菌。两组的杀菌率均超过99%，表明PCL/CS/Zn-WH纳米纤维膜能持续释放Zn2+，有效消毒，防止植入物感染，为骨修复提供一个无菌环境。

5、材料的生物相容性

Zn2+在骨科植入物中具有重要作用，高浓度Zn2+虽然具有强杀菌效果，但也可能带来细胞毒性。掺杂5% Zn-WH和PDA@Zn-WH的纳米纤维膜展现出显著的物理化学特性和抗菌性能。通过骨髓间充质干细胞（BMSCs）和内皮前体细胞（EPCs）的粘附和增殖来评估不同纳米纤维膜的生物相容性。结果显示，含有PDA@Zn-WH的纳米纤维膜更有利于细胞生长和增殖，从而提高了其作为骨科植入物的潜力。

6、神经发生特性

文章探讨了神经纤维在骨骼结构中的作用，以及骨内神经对骨代谢的调节作用。神经递质和神经肽等由周围神经分泌的物质对骨形成和修复至关重要。研究表明，含有感觉神经纤维的组织工程骨能成功修复大型骨缺损，且植入合作感觉神经纤维的组织工程骨在成骨方面更优。此外，镁合金也能通过促进神经肽分泌来促进骨再生。研究还评估了纳米纤维膜对神经细胞（RSCs和PC-12细胞）的生物相容性和神经发生的影响。结果表明，PDA@Zn-WH组可以通过持续释放Zn2+和Mg2+来促进骨缺损区域的神经再生。

7、成骨分化和血管化特性

人类骨骼组织遍布神经纤维，这些纤维在骨代谢中起调节作用，尤其在代谢活跃区域。研究表明，含有感觉神经纤维的组织工程骨在修复大型骨缺损时效果更佳。骨膜中的血管网络对骨修复至关重要，需要诱导血管生成和成骨分化。Ca2+、Mg2+和PO43−在干细胞增殖和分化中起关键作用，促进成骨分化和矿化。通过染色检测发现Zn-WH组和PDA@Zn-WH组在成骨诱导方面表现优于PCL和CS组，I型胶原蛋白和钙结节含量显著更高。Zn2+和Mg2+通过MAPK/ERK信号通路促进间充质干细胞成骨分化。管腔形成实验显示，Zn-WH和PDA@Zn-WH组的血管生成诱导能力优于PCL和CS组，PDA@Zn-WH组表现最佳。Zn-WH和PDA@Zn-WH组对EPC迁移的促进效果也更强，表明它们具有强大的血管生成诱导能力。因此，添加Zn-WH纳米颗粒能显著增强仿生骨膜的成骨和血管生成诱导性能，PDA@Zn-WH纺丝膜有望通过“成骨-血管化”耦合效应实现更好的成骨修复效果。

8、体内成骨和神经血管化

本研究探讨了在骨骼再生中重建神经血管化网络的重要性，并验证了纳米纤维膜在促进神经血管化方面的效果。通过在SD大鼠颅骨缺损模型中植入纳米纤维膜，并在术后第七天进行免疫荧光染色，评估了神经修复和血管生成效果。结果显示，PDA@Zn-WH组在CD31和β3-微管蛋白表达上高于其他组，表明其在神经血管化方面效果最佳。3D重建显示PDA@Zn-WH组修复效果显著，优于其他组。骨体积分数（BV/TV）分析也显示PDA@Zn-WH组骨生成效果最高，且高于Zn-WH组，表明PDA促进新骨生长。组织学检查进一步确认了这些发现，PCL/CS/PDA@Zn-WH组硬组织面积最大。ICP分析结果显示PCL/CS/PDA@Zn-WH组释放更多Ca2+和Mg2+，促进骨组织再生。这些结果表明，PDA@Zn-WH纳米纤维膜通过“成骨-血管化”耦合效应，有效促进了骨缺损区域的神经血管化和骨再生。

结论：

本研究成功开发了一种具有良好细胞相容性的成骨诱导纳米纤维膜，能够有效促进骨再生。首先优化了PCL和CS的比例以获得最佳的物理性能，随后评估了不同量的Zn-WH或PDA@Zn-WH掺杂对物理性能的影响，并选择了最佳组进行生物学评估。抗菌性测试显示PCL/CS/PDA@Zn-WH组对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有良好的抗菌效果。体外实验结果表明，PCL/CS/PDA@Zn-WH组在成骨和神经血管化方面潜力最大。体内实验通过H&E和Masson染色进一步证实了该组在成骨和神经血管化方面的效果优于其他组。因此，PCL/CS/PDA@Zn-WH纳米纤维膜作为一种仿生骨膜，对于临床治疗骨缺损和促进骨再生显示出巨大的潜力。