文献解读丨葛根素通过调节肠道菌群和抑制p38MAPK信号通路 延缓乳腺衰老

英文标题：

Puerarin Delays Mammary Gland Aging by Regulating Gut Microbiota and Inhibiting the p38MAPK Signaling Pathway

1.摘要：

培养细胞：小鼠乳腺上皮细胞（mMECs）

培养效果：使用BS-1105产品培养的细胞生长状态良好

2.前言

乳腺组织对人类和动物的哺乳至关重要，健康的乳腺可以为后代提供高质量的哺乳，维持其健康发育。有研究表明，乳腺衰老可能与乳腺癌的发生发展密切相关。长期慢性炎症反应可能改变乳腺内环境，引发细胞形态和功能的改变，甚至致癌突变。在生产动物中，乳腺衰老可能导致产奶量和泌乳寿命降低。衰老是细胞应激反应，分为生理性和病理性衰老。细胞衰老是衰老的重要标志，炎症和氧化应激是导致细胞衰老的重要因素。衰老细胞分泌的SASP会改变周围微环境，激活p38MAPK、NF-κB和mTOR信号通路，加速细胞衰老。相关研究也表明，肠道菌群在组织器官衰老中起重要作用，可以通过调节肠道微生物群的丰度来逆转肠道和大脑的衰老。葛根素是一种从葛根中提取的异黄酮物质，具有抗炎、抗氧化等药理作用。研究发现，葛根素可能通过调节肠道菌群和改善肠道菌群代谢产物，以及直接作用于乳腺组织，抑制p38MAPK信号通路，来延缓乳腺衰老。本研究首次发现葛根素可以通过p38MAPK-线粒体途径直接对乳腺组织产生抗衰老作用，并通过调节肠道菌群抑制乳腺中p38MAPK的激活，从而延缓乳腺衰老。

3.结果与讨论

3.2葛根素延缓慢性炎症性乳腺衰老

慢性炎症通过氧化损伤、DNA损伤和干细胞衰老加速衰老过程。在LPS诱导的乳腺组织衰老模型中，SA-β-gal活性升高，而葛根素能够降低这种活性，表明葛根素可能具有抗衰老作用。葛根素处理能够降低MDA（丙二醛）水平，同时提高SOD（超氧化物歧化酶）、CAT（过氧化氢酶）和GSH（谷胱甘肽）水平，表明葛根素具有减轻氧化应激的能力。葛根素下调了SASP基因中IL-1β、TNFα、IL-6、CXCL1、CXCL5和CXCL9的mRNA水平，这进一步支持了葛根素的抗炎和抗衰老作用。葛根素处理显著下调了p53、p21和p16蛋白水平，这些蛋白是细胞衰老的标记物。葛根素显示出延缓乳腺衰老的药理作用，通过降低氧化应激和炎症反应，以及调节与衰老相关的蛋白表达。

3.3. 葛根素在乳腺衰老过程中保护血-乳屏障的完整性

血脑屏障的破坏是衰老过程中主要的病理变化之一血-乳屏障也是抵抗病原体侵袭、维持乳腺微环境平衡的重要生物屏障，在乳腺衰老过程中也可能遭到破坏，通过研究葛根素对乳腺衰老过程中血-乳屏障的影响，实验结果表明，葛根素能够减轻FITC白蛋白渗透，能够显著促进Claudin3、Occludin和ZO-1的蛋白水平的表达，从而保护血-乳屏障。葛根素能够逆转LPS引起的紧密连接蛋白表达下调和分布异常，改善乳腺卵泡腔内紧密连接蛋白的分散和不规则分布。综上所述，葛根素可以通过促进紧密连接蛋白的表达来修复乳腺衰老过程中血乳屏障的损伤。

3.4葛根素调节肠道微生物群

就微生物群、炎症介质和免疫系统之间的相互作用而言，肠道微生物群的调节有助于促进生理和病理衰老过程，为了研究葛根素是否对肠道微生物群有调节作用，使用16S rRNA测序检测小鼠粪便。为了评估葛根素对肠道菌群丰富度和物种多样性的影响，我们分析了α多样性。结果表明，葛根素处理可以增加微生物群落的丰度和多样性。使用β-多样性分析来评估各组之间肠道微生物群组成和分布的差异。结果显示，LPS组小鼠的肠道微生物群与对照组明显不同，而葛根素减轻了LPS诱导的这种转变。随后，在门、科和属水平上分析了三组之间肠道微生物群物种丰度的差异。结果表明，葛根素可能通过调节肠道菌群来延缓慢性炎症反应诱导的乳腺衰老。

3.5 葛根素通过调节肠道微生物群延缓乳腺衰老。

为了进一步研究葛根素是否通过调节肠道微生物群来延缓乳腺衰老，我们在小鼠中去除肠道微生物群后进行了FMT（图4A）。结果表明，葛根素处理组的SA-β-gal，SASP基因mRNA水平和p53、p21、p16蛋白水平降低，发现p38MAPK激活在细胞衰老中起着重要作用。因此，进一步研究乳腺衰老过程中肠道菌群对p38MAPK激活的影响。结果显示，葛根素处理组p38MAPK的磷酸化水平明显降低，表明葛根素可能通过肠道菌群抑制p38MAPK的激活，从而延缓乳腺衰老。通过对衰老相关指标的检测。结果显示，与LPS组相比，乳酸、醋酸钠和丙酸钠处理的mMECs能够显著降低SA-β-gal活性和p53、p21、p16蛋白水平以及SASP基因mRNA水平。这些结果表明，葛根素可能通过肠道菌群的相关代谢物延缓乳腺衰老。

3.6葛根素抑制乳腺衰老过程中MAPK信号通路的激活

为了进一步探讨葛根素延缓小鼠乳腺衰老的作用机制，我们采用网络药理学方法预测葛根素延缓乳腺衰老的作用靶点和信号通路，发现葛根素与疾病共有30个共同靶点，核心靶点包括TP53（p53）、TNF、PPARG（PPAR-γ）、IL2、IL-1a、EGFR和ITGAM。GO分析筛选出与葛根素相关的10种生物、细胞和分子功能，涉及急性炎症反应、炎症反应调节、神经元凋亡过程的正调控，以及免疫系统过程、转录后基因沉默和RNA-to-gene沉默的负调控。KEGG富集分析显示，JAKSTAT信号通路、MAPK信号通路、亚麻酸代谢等显著富集。结合网络药理学结果，探讨葛根素对乳腺衰老过程中MAPK信号通路的影响。结果显示，与LPS组相比，葛根素显著下调了ERK1/2、JNK1/2和p38MAPK的磷酸化水平。上述结果提示葛根素可以抑制乳腺衰老过程中MAPK信号通路的激活。

3.7葛根素延缓LPS诱导的mMES细胞衰老

为了进一步探讨葛根素在mMECs细胞衰老中的作用，在体外用LPS处理mMECs。结果显示，p53、p21和p16的表达在36和48 h时显著升高，其中在36 h时尤为显著。葛根素在0-150 μM浓度下对mMECs细胞活力无影响，表明安全。150μM葛根素处理能显著降低p53、p21和p16的表达，表明其可能延缓细胞衰老。葛根素能降低LPS诱导的炎症反应，减少iNOS和COX-2的表达。降低SA-β-gal活性，下调MDA水平，上调SOD、CAT、GSH水平，降低SASP基因中炎症因子的mRNA水平，表明其抗炎和抗衰老作用。为了进一步探讨葛根素是否可以延缓炎症反应诱导的细胞衰老，我们检测了衰老相关指标的变化。结果显示，葛根素可以降低SA-β-gal活性，下调MDA水平，上调SOD、CAT、GSH水平，降低SASP基因中炎症因子的mRNA水平，表明其抗炎和抗衰老作用，为进一步明确葛根素对mMECs细胞衰老的影响，我们检测了p53、p21和p16的表达水平。结果显示，葛根素处理可显著下调p53、p21和p16的表达。综上所述，葛根素可以延缓LSP诱导的mMECs细胞衰老。

3.8葛根素主要抑制p38MAPK磷酸化延缓mMES衰老

已经证明葛根素可以抑制乳腺衰老中MAPK信号通路的激活，为了进一步阐明葛根素是通过抑制MAPK信号通路的激活来发挥其抗衰老作用，我们在体外进行了验证。葛根素显著下调了ERK1/2、JNK1/2和p38的磷酸化水平。使用GDC-0994、SP600125和SB203850分别抑制ERK、JNK和p38活性后，这些抑制剂均能降低SA-β-gal活性和p53、p21、p16蛋白水平，其中SB203850的效果最为显著。因此，p38MAPK磷酸化在促进mMES细胞衰老过程中起着重要作用。模拟葛根素与p38蛋白之间的分子对接，结果显示葛根素与p38蛋白之间的结合能量具有统计学意义，表明葛根素可能直接作用于p38MAPK。激活p38MAPK后，葛根素处理能够降低SA-β-gal活性和p53、p21、p16蛋白水平。综上所述，葛根素主要通过抑制p38MAPK的磷酸化来延缓mMES的细胞衰老。

3.9葛根素通过靶向p38MAPK改善mMES细胞衰老中的线粒体功能障碍

线粒体功能障碍和细胞衰老都是衰老的标志，两者密切相关因此，为进一步探讨了葛根素对mMES细胞衰老条件下线粒体功能的影响，检测线粒体ROS （mtROS）和线粒体膜电位（MMP）的水平。结果表明，综上所述，葛根素能够通过靶向p38MAPK促进MFN1的表达，改善mMECs细胞衰老过程中的线粒体功能障碍。

4.结论

葛根素可能通过直接作用于乳腺组织而起到延缓衰老的作用。这可以通过靶向mMEC中的p38MAPK线粒体途径来实现。此外，葛根素可以调节肠道菌群组成，促进有益菌定植，促进乳酸、乙酸、丙酸的产生，通过血液循环进入乳腺，起到抗衰老的作用。